培养细胞所要经历的各个时期

培养细胞的生存环境是培养瓶、器皿或其他容器，生存空间及营养是有限的。当细胞增殖到一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液，使细胞更好地生存，这一过程称之为“传代”。值得注意的是每次传代细胞在生长和增殖方面受到一定的影响。下面山东顺盈服务生物科技有限公司带我们一起来看一看培养细胞所要经历的各个时期有哪些。

一、生命期

指细胞在培养过程中持续增殖和生长的时间。一般根据细胞种类、性状和原供体的年龄的情况而定。

如：二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生命，细胞便开始凋亡(apoptosis)。 细胞在生存过程中经历以下三个阶段

1、原代培养期

组织到第一次传代时间大约为1～4周。特点是细胞移动活跃,但分裂不旺盛,多呈二倍体核型。原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。各细胞的遗传性状互不相关，细胞相互依存性强，如果把这种稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养,细胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明细胞独立生存性差。

2、传代期

初代培养细胞一经传代便称之为细胞系

特点是细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型，也叫二倍体细胞系为了保存二倍体细胞性质，细胞应在初代或传代早期冻存为好。一般细胞在10代以内冻存。

冻存配方：向培养液加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。存于在液氮中温度可达到－196℃，可长期储存。如解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞性状不受影响，成为保存细胞最主要的手段。

3、衰退期

特点：细胞仍生存 增殖减慢 不增殖 轮廓增强 衰退凋亡

注意：细胞在三期中的任何一期（一般发生在传代后期或衰退期）在某些因素影响下,如血清质量不佳、病毒污染、温度和pH不稳等,细胞可能发生自发转化;

细胞可能获得永生性或称为恶性性。细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体称为连续细胞系。而细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体(heteroploid)接触抑制消失。

二、生存期

“ 一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段：

1、潜伏期

接种 经过 悬浮期(细胞质回缩,胞体呈圆球形) 贴壁。

初代培养细胞 经过 10～24小时或更多时间。

连续细胞系和癌细胞系 经过 10～30分钟 贴附。

贴附现象是一个非常复杂和受多种因素的影响。

影响细胞贴附：底物表面不干净，影响细胞贴附。

利于细胞贴附：底物表面带有阳性物质与特殊物质:纤粘连蛋白、细胞表面蛋白。

这些物质有的存在与细胞表面,有的来自血清。

潜伏期特点：

长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关。

(1)、细胞贴附后进入潜伏期,细胞无增殖。少见分裂相，细胞有运动活动。

(2)、初代培养 细胞潜伏期约为24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6～24小时。

(3)、细胞接种密度大潜伏期短。

(4)、细胞出现分裂相增多时，标志细胞进入指数增生期。

2、指数增生期

特点：细胞增殖最旺盛阶段,分裂相增多。

细胞分裂指数 ：表示每1000个细胞中的分裂相数。

条件：分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。

细胞分裂指数：初代细胞：在0.1%～0.5%之间% ,连续分裂细胞和肿瘤细胞：3 ～5%。

指数增生期是作为细胞一代活力最好的时期,是进行实验最好和最主要的阶段。

指数增生期持续3～5天，细胞数量增多后生长空间变小，细胞相互接触可连接成片。

正常细胞：细胞相互接触能抑制细胞运动，这种现象称为接触抑制(contact inhibition)。

肿瘤细胞：没有这种现象，可作为区别正常与肿瘤细胞的标志之一。当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展，使细胞发生堆积(piled up)。

由于细胞不断增殖分裂，细胞数量持续增多，培养液的营养成分减少，代谢产物增多，细胞受营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制(Density inhibition),导致细胞分裂停止。

3、停滞期(stagnate phase)

细胞量和密度达到饱和，细胞停滞增殖。表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平，也称为平顶期(plateau）。

特点：细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。